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    生化分离介质

    凝胶层析
    发布时间:2020-04-27


    1. 凝胶层析的基本原理:

           凝胶层析(Gel Chromatography)是利用凝胶层析介质的网状结构,根据分子大小进行分离的一种方法。其基本原理是含有不同尺寸大小的分子进入层析柱后,较大的分子不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部,而与流动相一起流出层析柱;较小的分子可通过部分孔道,更小的分子可通过任意孔道扩散进入珠体内部。这种颗粒内部扩散的结果,使小分子向柱下的移动减慢,从而样品根据分子大小的不同依次按一定顺序从柱内流出,一般是大分子先流出来,小分子后流出来,从而达到分离的目的。凝胶层析介质像分子筛一样,将大小不同的分子进行分离,因此,凝胶层析又叫分子筛层析或称尺寸排阻层析。

           层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质,多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质,小分子物质能进入其内部,流下来速度慢,而大分子物质却被排除在外部,下来的速度快,当混合溶液通过凝胶过滤层析柱时,溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

    2. 凝胶层析的优点:

           分离条件温和,可在多种条件下工作。凝胶层析介质为不带电荷的惰性物质,不与溶质分子发生作用,分离条件温和,蛋白质维持原结构,故不易变性,可保持被分离成分的理化性质。凝胶层析可在相当广的温度范围内进行操作,因此更适用于某些不稳定的分子,尤其是那些对pH值、金属离子浓度敏感的、对环境要求苛刻的生物分子的分离。为满足蛋白质的特殊要求,可以在多种条件下进行分离,如在高离子强度、低离子强度,以及脲、盐酸胍存在的环境下进行分离。

           蛋白质回收率高。目标蛋白质的回收率很高,几乎可达100%,且实验重现性好。

           应用面广泛。工作范围广,分离分子量的覆盖面大,可分离相对分子质量从几百到数百万的分子,尤其适用于活性大分子的分离。凝胶层析对环境的要求不严格,可以在低温下操作,也可在37℃下进行分离,还可以根据蛋白质的需求选用多种缓冲液。

           设备简单,易于操作。凝胶层析的设备简单,易于操作,周期短,每次分离之后介质不需再生,故可连续使用,有的凝胶层析柱可连续应用几百次甚至上千次。

    3. 凝胶层析的应用:

           脱盐:高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质,可以用凝胶层析法除去,这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。

           分离提纯:凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖、核酸、激素、疫苗、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力,可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。

           分子量的测定:用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内,在同一条件下层析,记录每一分钟成分的洗脱体积,并以洗脱体积对分子量的对数作图,在一定分子量范围内可得一直线,即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时,可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后,根据物质的洗脱体积,在标准曲线上查出它的分子量。

           高分子溶液的浓缩:通常将凝胶层析介质干胶投入到稀的高分子溶液中,这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中,而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外,再经离心或过滤,将溶胀的凝胶分离出去,就得到了浓缩的高分子溶液。

           凝胶层析因其条件温和,操作简单,蛋白质回收率高及重现性好等特点,在生物化学、医学及分子生物学等方面获得广泛的应用,如蛋白质、酶、多肽、抗体及激素的分离纯化,分子量测定及多聚体研究,临床分析,热原去除及药物制备等,在轻工食品等领域也得到极为广泛的应用。



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